当研究室では、DNAの組換え、修復、及び複製といった遺伝子の基本的機能（セントラルドグマ）を中心に、「DNAトランスアクション」という観点で、総合的に解明することを試みています。そのために、原核生物の大腸菌及び真核生物の酵母を主たる実験材料として、分子遺伝学的手法から、生化学的、構造生物学的手法など、種々の手法を取り入れ、トータルなアプローチを行い、この重要な問題に取り組んでいます。
(1) DNA相同遺伝子組換えの分子機構
“Holliday 構造”と呼ばれている相同組み換えの反応中間体は、２分子の相同なDNAが、相同鎖を相互交換したユニークなDNA構造体です。当研究室では、Holliday構造のDNA交叉点移動反応を触媒する大腸菌酵素 RuvA・RuvBと、Holliday構造を切断分離する酵素 RuvCの反応機構を遺伝学、生化学、及び構造生物学的手法を用いて解析しています（図１）。現在、真核生物におけるHolliday構造のプロセッシングの仕組みを明らかにするために、酵母を主な実験材料として新規の組換え修復遺伝子の同定と機能解析を行っています。
図１：RuvABC蛋白質によるHolliday構造のプロセッシングのモデル
RuvAは４量体、RuvBは６量体を活性型としてRuvA・RuvB蛋白質複合体を形成する。このRuvAB複合体は、ATP加水分解のエネルギーを利用してHolliday構造の分岐点移動を促進するモーター蛋白質として働く。RuvCはHolliday 構造を切断するエンドヌクレアーゼである。
図２：ゲノム安定性維持機構の破綻が発癌を促進する |
(2) DNA複製時におけるゲノム安定性維持機構
ゲノムDNA は、放射線などの外的要因だけでなく、細胞の代謝産物などの内的要因によって損傷を受けている。これらの損傷に対して、DNA修復、チェックポイント機構などが働き、ゲノムDNAの安定性が維持されている。
しかしながら、この損傷部位にDNA複製フォークが衝突するとフォーク進行阻害が引き起こされる。DNA複製の阻害は細胞にとって致死となるため、障害を取り除いて複製を再開するメカニズムは、すべての生物にとって重要な問題である。これらのシステムに異常が生じた場合、突然変異頻度の上昇、重複、転座等のゲノム不安定化が引き起こされ発がんの原因になると考えられている（図２）。
このようなDNA複製の阻害が引き起こす内在性のゲノム不安定化を防ぐために、DNA複製、組換え、修復の機構が協調しながら働いていることが最近の関連分野の研究で明らかになり、ゲノム安定化維持機構という観点からこれらを統合して研究することが重要となっている。私達は、この複製フォーク阻害を回避する機構に関与する遺伝子を多数分離して、それらの機能を解析しています。また、私達の研究対象としている遺伝子は全てヒトにも存在し、いくつかは高発がん性や早期老化を引き起こすゲノム不安定化症候群の原因遺伝子であることから、このメカニズムの詳細な解析が、ヒトにおけるがん化や老化の原因を解明するうえで重要な手掛かりとなると考えています。
2-1) RecQヘリケースファミリーの解析
RecQタンパク質は、大腸菌からヒトまで高度に保存され、DNA複製の進行が阻害された時に働いてゲノム安定性維持に関与している。ヒトのRecQホモログであるBLM及びWRNは、それぞれ高発癌性のブルーム症候群や早期老化が現れるウェルナー症候群の原因遺伝子産物として同定された遺伝子である。我々は、DNA損傷や複製阻害に対する細胞の応答機能を解明する目的で、RecQヘリケースファミリーの解析を行っています。
図3：RecQ蛋白質の複製阻害からの回復過程における役割 。RecQヘリケースは、複製阻害を引き起こす障害を取り除くと共に、センサー蛋白質としてRecAを介したチェックポイント機能の活性化及び相同組換え機能によるDNA複製の進行再開に重要な働きをしている。
2-2) PCNAのユビキチン化制御の分子機構
DNA損傷や複製阻害に応答してPCNAはユビキチン化修飾を受ける。この制御因子として働いていると考えられるMgs1やSrs２タンパク質の機能解析を通して、PCNAを中核とした複製阻害を克服する機構を明らかにしたいと考えています。
2-3) F-box DNAヘリケース（Fdh1）の機能解析
放射線により切断されたDNAや、DNAの複製中に障害にあって崩壊してしまった複製フォークは、DNAの相同組換えによって正確に修復されます。相同組換えは、DNA切断末端の加工、相同なDNAの検索とDNAの鎖交換反応、その結果生成される組換え中間体の解離といった多くの過程が数多くのタンパク質の制御により進む複雑な反応です。私たちは相同組換えを制御する５つの新たなタンパク質を、分裂酵母を用いて見出し、その具体的な役割を解析しています。そのうちのひとつのFbh1はＦボックスモチーフを持ちユビキチンリガーゼE3の１種のSCF複合体を形成するユニークなDNAヘリカーゼであって、組換え中間体の解消に働くことを明らかにしてきました。