感染症学免疫学融合プログラム推進室

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研究グループ

准教授藤井 穂高
助教藤田 敏次

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研究内容

遺伝子座特異的生化学的ゲノム機能解析法の開発とその応用
 転写やエピジェネティック制御をはじめとするゲノム機能発現の分子機構の解析は、従来、主に遺伝学的解析や試験管内での生化学的解析によって進められてきた。しかし、こうした手法では分子機構の解明が困難であるか、できたとしても十年単位の長い時間が必要であった。こうした状況を変えるため、特定ゲノム領域クロマチン構造の non-biased 解析を目指し、新規方法論として、insertional chromatin immumoprecipitation (ChIP) (iChIP) 法とengineered DNA-binding molecule-mediated ChIP (enChIP) 法から構成される遺伝子座特異的ChIP法を開発した。
 iChIP法は、(i) 細菌のDNA結合蛋白であるLexAの結合配列 (LexA BE) を、解析対象ゲノム領域近傍に挿入した細胞を樹立、(ii) タグを付けたLexA DNA結合ドメイン (LexA DB) の上記細胞への発現、(iii) 必要があれば、ホルムアルデヒド等でクロスリンク後、超音波処理または制限酵素処理等によりゲノムDNAを断片化、(iv) 上記タグを認識する抗体による免疫沈降により、LexA DBが結合したDNA-蛋白複合体を単離、(v) クロスリンクをはずし、複合体中の蛋白質・DNA・RNAを同定、という手順による(図左)。
fig.1

図. 遺伝子座特異的クロマチン免疫沈降法
iChIP法とenChIP法から構成される。

 enChIP法は、(i) zinc-finger 蛋白質やtranscription activator-like (TAL) effector蛋白質、不活性型Cas9蛋白質 (dCas9) とガイドRNA (gRNA) の複合体を用いたCRISPRシステム等からなるタグ付き標的DNA配列結合分子の解析対象細胞への発現、(ii) 必要があれば、ホルムアルデヒド等でクロスリンク後、超音波処理または制限酵素処理等によりゲノムDNAを断片化、(iii) 上記タグを認識する抗体による免疫沈降により、DNA-蛋白複合体を単離、(iv) クロスリンクをはずし、複合体中の蛋白質・DNA・RNAを同定、という手順による(図右)。
 遺伝子座特異的ChIP法は、(I) 解析対象ゲノム領域に結合する分子が、DNA、RNA、蛋白質等、分子種に関わらず同定できる、(II) 低コピー数のゲノム領域に結合する分子の同定が可能である、といった既存の方法には無い優れた特質を持っている。遺伝子座特異的ChIP 法を用いることで、特定ゲノム領域に結合する未知の分子(蛋白質、DNA、RNA、その他)の網羅的同定が可能である。
 現在、遺伝子座特異的ChIP 法を用いて、
(a) リンパ球分化誘導・維持、(b) 嗅覚受容体の発現制御、(c) インスレーター機能、(d) DNA二重鎖切断の認識及びその修復、(e) エピジェネティック機序による癌抑制遺伝子の発現抑制
といった興味深くかつ重要な生命現象の分子機構の解明を目指して研究を進めている。

最近の代表的な論文

  1. Fujita T, Asano Y, Ohtsuka J, Takada Y, Saito K, Ohki R, Fujii H. Identification of telomere-associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP).Sci Rep. 2013 Nov 8;3:3171.
  2. Fujita T, Fujii H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated proteins by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Biochem Biophys Res Commun. 2013 Sep 13;439(1):132-6.
  3. Fujita T, Fujii H. Direct identification of insulator components by insertional chromatin immunoprecipitation. PLoS One. 2011;6(10):e26109
  4. Hoshino A, Fujii H. Insertional chromatin immunoprecipitation: a method for isolating specific genomic regions. J Biosci Bioeng. 2009 Nov;108(5):446-9.
  5. Saint Fleur S, Hoshino A, Kondo K, Egawa T, Fujii H. Regulation of Fas-mediated immune homeostasis by an activation-induced protein, Cyclon. Blood. 2009 Aug 13;114(7):1355-65.

 

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